зарыл болгон белок тазалыгына даражасы белок арналган акыркы колдонууга көз каранды.
Кээ бир колдонмолор үчүн, бир чийки көчүрмөсү жетиштүү. Бирок, мисалы, тамак-аш жана дары-дармек сыяктуу эле башка максаттар үчүн, тазалыктын жогорку деңгээл талап кылынат. Бул бир нече белок тазалоо ыкмалары, адатта, тазалануу бир катар кадамдарды пайдаланылат жетишүү үчүн.
Ар бир белок тазалоо кадам адатта продукт жоголгон кээ бир даражада пайда болот. Ошондуктан, идеалдуу белок тазалоо стратегиясы тазалануу жогорку деңгээл аз тепкич-жылы кайсы бири болуп саналат. колдонуу үчүн кандай кадамдарды жасаганын тандоо өлчөмү, акысыз, эригичтиги жана максаттуу белок башка касиеттерине көз каранды. төмөнкү ыкмалары бир cytosolic белокту тазалаш үчүн абдан ылайыктуу болуп саналат. cytosolic белок комплекстерин тазалоо кыйла татаал болуп саналат жана, адатта, ар кандай ыкмалары колдонулат деп талап кылат.
Белоктун даарат биринчи кадамдар
Клеткадагы (клетканын ичиндеги) белоктор тазаланып биринчи кадам чийки сүзүлгөн даярдоо болуп саналат.
көчүрмө клетканын өзүнөн бардык белоктордун, жана кээ бир кошумча макро, cofactors жана азык татаал аралашмасынан камтыйт. чийки экстракты жана биотехнология айрым өтүнмөлөр үчүн колдонулушу мүмкүн, бирок, таза бир маселе болсо, анда кийинки тазалануу кадам артынан керек.
Crude белок үзүндүлөрүн химиялык жана пайдалануу менен ишке ашат клетка lysis, тарабынан уюлдук сыныктарды жоюу жолу менен даярдалат энзимдерди , sonication же French Press. урандыларды экстрагирлөө алып жатат, supernatant кайтарылат. клетка сыртындагы протеиндер чийки даярдыктар жөн экстрагирлөө менен клеткаларды алып салуу менен алынган болушу мүмкүн.
Бир Анткени биотехнология жана бурмаланып кетпегендигин жогорку температурага чыдай алат Энзимдер жана жогорку атайын ишин сактап калуу менен: арыздарды, thermostable энзимдер үчүн суроо-талап бар. Аларды өндүрүү Жандуулар кээде extremophiles деп саналат. зарыл болсо, ысыкка чыдамкай белок тазалоого бир жеңил мамиле анан чечим муздатуу (Ошентип, жакшыртууга же кайрадан эрийт үчүн thermostable энзим жол, ысытууда аралашманын ичине башка белокторго башкача көрсөтүүгө болот. денатуралдаштырылган белоктор, анан экстрагирлөө тарабынан алып салынышы мүмкүн.
Ара Тазалоочу Steps
Мурун, бир чийки сүзүлгөн бир белок тазалоого жалпы экинчи кадам жогорку Осмос күч (мисалы, туз чечимдер) менен чечүүгө жаан-чачын болгон. чийки көчүрмөдө чагылдырылууга нуклеиндик кислоталар арзанга купоросу же protamine купоросу менен түзүлгөн агрегаты Гиресун тарабынан алып салынышы мүмкүн.
Белоктун жаан-чачын, адатта, туз аммоний купоросу менен жүзөгө ашырылат.
Ар түрдүү протеин аммоний купоросу ар байытуу боюнча бөлүнүп калат. Жалпысынан алганда, жогорку молекулярдык салмагы белоктор аммиак купоросу аз боюнча бөлүнүп чыгышы. Salt жаан-чачын, адатта, тазаланып протеин алып келбейт, бирок бир аралашма бир күтүүсүз белокторду жоюу жана үлгүсүн топтоло жардам берет. эритмеси туздар, андан кийин майда тешиктүү кагаздай бир кесим, чыпкалап, же гел салуу колонны аркылуу гемодиализ менен алынып салынат.
Заманбап биотехнологиянын протоколдор көп стандарттык жол-жоболор үчүн даяр чечүүнү камсыз көп экономикалык-бар буюм-артыкчылыктарды. Белоктун тазалоо көп электер жана даяр гел чыпкалоо тилке аркылуу жүзөгө ашырылат. Эгер чын көрсөтмөлөрүнө ылайык жана туура чечүү туура көлөмүн кошууга жана жаңы эксперимент идишине eluant (рубриканын башка аягына чыккан кайсы) жыйноо, ал эми учурда белгилүү узундугун күтүп турат.
- ХИМИЯ слесардык жогорку тилке аркылуу же дардын HPLC жабдууларды колдонсок болот. HPLC менен бөлүү кайтарым-этап, ион алмашуу, же көлөм-чыгарылганда ыкмалар менен аткарылышы мүмкүн жана үлгүлөрдү диод тизилип, же лазердик техниканын жардамы менен табылды.
Белоктун Элестетүү жана даарат маселелери баа берүү
- Ит-этап колонны (RPC), алардын салыштырмалуу hydrophobicities негизинде белокторду ажыратат. Бул ыкма өтө тандап, бирок эритмелер керектелет. Кээ бир белоктор туруктуу эритүүчүлөр менен денатуралдаштырылган жана RPC учурунда мүмкүнчүлүгүн жоготот. Ошондуктан бул ыкма максаттуу протеин ишин сактап калуу үчүн зарыл болгон өзгөчө болсо, бардык өтүнмөлөр боюнча сунуш эмес.
- Ion-алмашуу колонны айып менен белоктордун бөлүү билдирет. Мамычалар да гидридтин алмашуу же өздүгүн күбөлөндүрүүчү алмашуу үчүн даярдалган болот. Анион алмашуу мамычалар терс заряддуу белокторду өзүнө тарткан оң заряддуу бир туруктуу этабын камтыйт. Катион алмашуу мамычалар заряддуу белокторду тартуу арткы, терс заряддуу бусы болуп саналат. максаттуу белок (лор) Elution ар бир белоктун акы иш тобунун өзгөрүшүнө же зыянсыздоо натыйжасында тилкеде, рН өзгөртүү жолу менен ишке ашырылат.
- Ири молекулалар колонны тилкеде кайчылаш-шилтемеленген Полимердин аркылуу тез жол-жылдан бери Size-салуу колонны (гел чыпкалоо) анча алыс көп белокторду ажыратат. чоң белоктор аз белоктор ал эми Полимердин тешикчелерди айкалышып, алардын кем-түз маршруту аркылуу, колонны колонна кыдырып көбүрөөк убакыт жок. Элюаты elution убактысына жараша протеиндерди бөлүп Түтүктөрдүн бир катар алынат. Гэл чыпкалоо максаттуу белок алгач катарга кошулган бир аз elution көлөмдө чогултулган, себеби бир белок үчүн иргеп топтоо үчүн пайдалуу курал болуп саналат. Анткени, алардын экономикалык натыйжалуулугун Окшош чыпкалоо ыкмалары ири масштабдуу протеин өндүрүү учурунда колдонулушу мүмкүн.
- Affinity колонны "уучу" же протеин тазалануу аяктоо үчүн абдан пайдалуу ыкмасы. колонны рубрикада Beads кайчылаш бири-бири менен байланышкан максаттуу белок үчүн атайын байлап Печ керек. белок анда акысыз Печ камтыган эритинди менен жуубай менен колонна алынып салынат. Бул ыкма башка ыкмаларына салыштырмалуу таза материалдар жана жогорку атайын иш берет.
- SDS-БЕТ аларга чоң таза терс зарядды берүү белоктордун уланат polyacrylamide гел electrophoresis SDS (натрий dodecyl купоросу) катышуусу менен аткарылган эмес. бүт белоктордун айыптоо кыйла бирдей болгондуктан, бул ыкма дээрлик толугу менен, алардын өлчөмү негизинде бөлүнөт. SDS-БЕТ көп учурда бир катар ар бир кадам кийин белок тазалыгын сыноо үчүн колдонулат. керексиз белоктор акырындык менен аралашмасы алынып жатканда, SDS-БЕТ Лари боюнча телегейи тегиз аскеринин саны керектүү белок атынан бир гана группа бар чейин төмөндөйт.
- Иммуно- төп колонны менен айкалышта колдонулуучу бир белок Элестетүү ыкмасы болуп саналат. белгилүү бир протеин пайда болушу үчүн антителолор жактырышат колонны тилкеде боюнча Печ катары колдонулат. максаттуу белок колонна кармалып, анда туздуу чечим же башка агенттер менен мамыча жуубай менен алынып салынды. Бул аралашманын калган ажыратылган бир максаттуу белок аныктоо антителолор кызматтарды ээлөө же белгилүү боёк менен жардам этикеткалары менен тыгыз байланышта.
булактар:
Zubay G. 1988 биохимия, 2-басылышы. Макмиллан Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia биотехнологиясы. 1999-протеин Тазалоочу окуу куралы, Edition AB. Amersham Pharmacia Биотехнология Inc. Жерси, АКШ. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.