бир режиминде (УРК) кабыл бөлүктөрүнөн кандайдыр өзгөртүү жыйынтыгы боюнча, же продукт түшүмүн жана сапатын жакшыртууга же кемсинтүү же жооп өзгөчөлүктөрүн жана сезимталдыкты жогорулатуу менен сапатын өзгөртө албайт. жыйынтыгы таасир параметрлери физикалык (мисалы, температура, цикл жолу) же химиялык да болушу мүмкүн (мисалы, шаблон топтолуу, энзимдердин түрү колдонулат). Төмөнкү ПКОнун ийгиликке таасир бир нече негизги себептери болуп саналат.
01 Таза лабораториясы шарттары
Бери ПКО, ДНКнын бир молекуланы аныктай алат, ал лабораториясында тунук шарттарды камсыз кылуу өтө маанилүү болуп саналат. Ар дайым жаңы кол кап кийип алып, тукумсуз айнек буюмдар, салууда жана пипетка акылдарын жана тукумсуз чечимдерди колдонуу менен ишти баштай электе иш аймакты тазалоо.
Ар дайым көзөмөл аллергия, шаблон ДНК жана энзим жок, жыйынтыгы оң үлгүдөгү зайым чындап эсебинен камсыздоого кирет.
Көпчүлүк адамдар жөнөкөй дарт аныктоо үчүн жалпы жана белгилүү бир атайын дайындалган көлөмдүү көп ПКОдо бөлүп коюлган эмес, чечимдерди өз топтомун үчүн кам көрүшөт. DNase жана RNase акысыз ПКО түтүктөрү, аэрозолдук туруктуу пипетка Сунуштар жана УК жарыкка менен үч жүздөн капюшондо иштеген, ошондой эле маселелерди азайтуу үчүн кандай жолдор менен.
02 химиялык компоненттери
- Ээ 18 24 негиздери
- жок орто түзүлүшкө ээ (мисалы, hairpin илмек)
- G / C жана A / T жуп бөлүштүрүлүшүн салмактуу беле
- 3-буту четине бири-бирин толуктап эмес,
- Бар ээрип температуралар (TM) 55 жана 65 градус менен, адатта, кар жаашы жөнүндө 5-10 градус annealing температурасы төмөн кар жаашы менен,
эки грунттарды үчүн Tm мыкты натыйжалары үчүн ушундай болушу керек.
03 аракеттенүүчү Mix: Template жана грунттарды
Оптималдуу Primer Бирикмелер 0,1 жана 0,6 micromoles / L ортосунда болуп саналат. Калыпка ДНКдагы (адам, бактериялык, плазмиддердин) түрүнө жараша өзгөрөт.
Калыпка өтө аз сандагы менен өсүшүнө айланышы номерлери же пайдалануу сыяктуу, жыйынтыктарын жакшыртуу үчүн башка стратегиясы бар "ысык баштаган." Ар дайым жакшы көзөмөл иретинде менен жаңы грунттарды сынап, алар белгилүү бир тажрыйба шарттарда иштөөгө толук ишенсек болот.
04 аракеттенүүчү Mix: энзим аракет
жооп аралаштыра эсептегенде MgCl2 топтолушу PCR жыйынтыктарын жана кылдаттык мамиле маанилүү ролду ойношу мүмкүн таасир этиши мүмкүн. Магний тастыктайт полимераз тааныйт чыныгы субстрат өндүрүү dNTPs менен эрүүчү комплекстерин түзөт.
төрт dNTPs бирдей эле полимераз ката азайтууга жардам берет. Мындай betaine айрым кошумчалар, BSA, жуугуч, DMSO, glycerol жана pyrophosphatase да энзим өзгөчөлүктөрүн же жооп натыйжалуулугун таасир этиши мүмкүн.
05 Thermocycler түрү
лабораториялык жабдууларды сатып жатканда, кээ бир thermocyclers так, каалаган температурасы сактоо башкаларга караганда азыраак так экенин эсибизден чыгарбайбыз.
Бул сиз оюндагыдай жооп кайтаруу же annealing температурасынын бир тар диапазондо талап грунттарды пайдалануу менен туш болгондо бир аймак жаткан арзан узак мөөнөттүү төлөп бербейт.
Сиз колдонуп жаткан thermocycler так брендин ылайык иштелип чыккан ичке тосмолуу жооп түтүктөрү, ошондой эле, буга суук оптималдаштырууга жардам берет.
06 Айлампа Орнотуулар
Түшүмдүүлүктүн өсүшү көбүрөөк шаблон күчөтүш үчүн аз энзим ордун толтуруу үчүн, ар бир 20 ирекет жөнүндө узартуу убакыт жогорулатуу аркылуу жетишүүгө болот. Адатта, аз 40 ирекет бир ethidium метилбромид-булганган боюнча көрүү үчүн көп топтолушу- 10 шаблон молекулаларын кем күчөтүш үчүн жетиштүү агароза Лари .